Біотехнічний комплекс імпульсної кондуктометрії і електроманіпуляції з клітинами тварин : автореф. дис. на здобуття наук. ступеня д-ра техн. наук : 05.11.17 - Біологічні та медичні прилади і системи

Abstract

В роботі розв'язана проблема створення загальної концепції, теоретичних основ, моделей, методів для біотехнічного комплексу кондуктометрії клітин тварин в імпульсному електричному полі (ІЕП) змінної напруженості, за допомогою яких обґрунтовані і визначені режими електроманіпуляції з клітинами тварин для застосовування в різних біотехнологічних процесах. Розглянуті загальні фізичні принципи поляризації мікрооб'єктів в різних електричних полях, обґрунтована необхідність візуалізації силових ліній поля для розрахунку параметру нової кондуктометричної комірки із змінною геометрією, розраховані параметри діелектрофорезу - частота ВЧ поля і оптимальна концентрація еритроцитів для візуалізації силових ліній, розроблена установка для діелектрофорезу і одержані картини силових ліній поля між різними мікроелектродами. Побудовані моделі клітини і її структурних елементів у зв'язку з дією ІЕП: електролітичної провідності цитоплазми, як провідника другого роду; провідності ооцита і 2-16-клітинних ембріонів у вигляді еквівалентних лінійної і нелінійної електричних ланцюгів; геометрична модель мембрани клітини у зв'язку з провідністю в різних розчинах; фізико-математична модель провідності клітини, побудована на основі вірогідності утворення електропір в мембрані. Приведені результати розробки вимірювальної схеми з розрахунком електричних характеристик імпульсного кондуктометра, методика вимірювань провідності з розрахунком апаратного параметру мікроелектродної комірки із змінною геометрією, метрологічна атестація розробленого вимірювального засобу. На модельних біооб'єктах одержані і проаналізовані закономірності зміни параметрів провідності під впливом основних зовнішніх факторів рідкого середовища (температура, осмотична концентрація) і ІЕП (напруженість поля). Головний параметр ІЕП - напруженість - використаний одночасно, як засіб ініціації провідності і як критерій впливу поля на клітину при електропорації і електропробої мембрани. За допомогою розробленої автоматизованої апаратури імпульсної кондуктометрії виконано електрозлиття різних клітин та отримані реконструйовані ембріони корови, химерні и модельні ембріони миші.

В работе решена проблема создания общей концепции, теоретических основ, моделей, методов для биотехнического комплекса кондуктометрии клеток в импульсном электрическом поле (ИЭП) изменяемой напряженности, с помощью которых обоснованы и определены режимы электроманипуляции с клетками животных для применения в различных биотехнологических процессах. Представлен научно-исторический аспект мирового развития методов электроманипуляции, выполнен аналитический обзор литературы по основным направлениям, которые касаются темы диссертации: теоретическое моделирование, экспериментальные данные и современные представления о биофизических механизмах электропорации искусственных липидных бислоев и мембран биологических клеток, поскольку это явление лежит в основе разработанного метода импульсной кондуктометрии; методы и аппаратура современной кондуктометрии и ее значение для отраслей промышленности и научных исследований в биологии; биомедицинские и технические приложения электропорации; состояние парков серийной специализированной для электроманипуляций с клетками животных и измерительной аппаратуры; возможность применения диэлектрофореза для визуализации проводящего объема микроэлектродной кондуктометрической ячейки с изменяемой геометрией. Рассмотрены общие физические принципы поляризации микрообъектов в электрическом поле; обоснована необходимость визуализации силовых линий поля для расчета аппаратного параметра новой кондуктометрической ячейки с изменяемой геометрией; рассчитаны параметры диэлектрофореза - частота ВЧ поля и концентрация эритроцитов для оптимальной визуализации силовых линий; разработана установка для диэлектрофореза и получены визуализированные картины силовых линий поля между различными микроэлектродами. Построены электрические модели клетки и ее структурных элементов в связи с действием ИЭП: электролитической проводимости цитоплазмы, как проводника второго рода; проводимости ооцита и 2-16-клеточных эмбрионов в виде эквивалентных линейной и нелинейной электрических RC-цепей; геометрическая модель микровилли мембраны клетки в связи с проводимостью в различных растворах; физико-математическая модель проводимости клетки, построенная на основе вероятности образования электропор в мембране. В работе приведены: результаты разработки измерительной схемы с обоснованием и расчетом электрических характеристик импульсного кондуктометра; теоретическое обоснование функции аппаратного параметра безкорпусной микроэлектродной кондуктометрической ячейки с изменяемой геометрией; методика измерений проводимости клеток и жидких сред; исследование метрологических характеристик и аттестация импульсного кондуктометра, а также рекомендации по применению методики и результаты измерения удельной проводимости клеток и жидких сред. Разработан автоматизированный биотехнический комплекс аппаратуры импульсной кондуктометрии на базе микроконтроллера, управляемого ПЭВМ. На модельных биообъектах (ооциты и 2-клеточные эмбрионы мыши) получены и проанализированы закономерности изменения параметров проводимости под воздействием основных внешних факторов жидкой среды (температура, осмотическая концентрация) и ИЭП (напряженность поля). Главный параметр ИЭП - напряженность – использован одновременно, как средство инициации проводимости и как критерий влияния поля на клетку при электропорации и электропробое мембраны. С помощью разработанной автоматизированной аппаратуры импульсной кондуктометрии выполнено электрослияние различных клеток и получены реконструированные эмбрионы коровы, химерные и модельные эмбрионы мыши.

The creation problem of general conception, theoretical bases, models, methods and biotechnical complex for animal cells conductometry in the pulse electric field (PEF) with varying strength is decided in dissertation, by which grounded and the modes of electromanipulation with the animal cells for application in different biotechnological processes are certain. The models of cell and its structural elements in connection with the PEF action are built: electrolytic conductivity of cytoplasm, as explorer of the second family; oocyte and 2-16-cellular embryos conductivity as equivalent linear and nonlinear electric schemes, which calculation is executed by the methods of radio engineering chains theory; geometrical model of cell membrane in connection with conductivity in different solutions; physics-mathematical model of cell conductivity, built on the basis of electro-pores formation probability in a membrane. General physical principles of micro objects polarization in different electric fields are considered; the necessity of field force lines visualization the for the calculation device parameter of a new conduct metric cage with changeable geometry is grounded; the parameters of dielectrophoresis are expected is frequency of the HF field and erythrocytes concentration for optimum visualization of force lines; setting is developed for dielectrophoresis and the visualized pictures of force lines in the field between different microelectrodes are got. The results of measuring scheme development with the calculation of electric descriptions of conductometer are resulted; method of conductivity measuring with the calculation of microelectrode cage new parameter with changeable geometry; research of metrological characteristics and attestation of pulse conductometer. On bioobject model conformities to the law of change of conductivity parameters under act of basic external factors of liquid environment (temperature, osmotic concentration) and PEF are got and analyzed (field strength). The main parameter PEF is strength – used simultaneously, as mean of initiation of conductivity and as criterion of influencing of the field on a cell during electroporation and breakdown of membrane.